31999L0027

DIRECTIVA 1999/27/CE DA COMISSÃO

de 20 de Abril de 1999

que fixa métodos de análise comunitários para a determinação do amprolium, do diclazuril e do carbadox nos alimentos para animais, altera as Directivas 71/250/CEE e 73/46/CEE e revoga a Directiva 74/203/CEE

(Texto relevante para efeitos do EEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva 70/373/CEE do Conselho, de 20 de Julho de 1970, relativa à introdução de modos de colheita de amostras e de métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais(1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Acto de Adesão da Áustria, da Finlândia e da Suécia, e, nomeadamente, o seu artigo 2.o,

(1) Considerando que a Directiva 70/373/CEE prevê que os controlos oficiais dos alimentos para animais, destinados a verificar a observância das condições estabelecidas de acordo com as disposições legislativas, regulamentares ou administrativas quanto à qualidade e composição dos alimentos para animais, sejam efectuados segundo modos de colheita de amostras e métodos de análise comunitários;

(2) Considerando que a Directiva 70/524/CEE do Conselho, de 23 de Novembro de 1970, relativa aos aditivos na alimentação para animais(2), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 45/1999 da Comissão(3), estabelece a indicação obrigatória na rotulagem dos teores de amprolium e diclazuril quando tais substâncias sejam incorporadas em pré-misturas ou alimentos para animais; que a autorização da utilização de carbadox como aditivo nos alimento para animais foi revogada pelo Regulamento (CE) n.o 2788/98 da Comissão, de 22 de Dezembro de 1998, que altera a Directiva 70/524/CEE do Conselho relativa aos aditivos na alimentação para animais no que respeita à revogação da autorização de determinados factores de crescimento(4); que é necessário um controlo oficial da eventual utilização ilegal de substâncias proibidas;

(3) Considerando que há que estabelecer métodos de análise comunitários para a pesquisa das referidas substâncias;

(4) Considerando que Directiva 71/250/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1971, primeira directiva que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais(5), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 98/54/CE(6), estabelece métodos de análise para, inter alia, a determinação da essência de mostarda e da teobromina; que, à luz do progresso científico e técnico, os métodos descritos já não satisfazem os objectivos pretendidos; que é, portanto, conveniente suprimir os métodos em questão;

(5) Considerando que Directiva 73/46/CEE da Comissão, de 5 de Dezembro de 1972, quarta directiva que estabelece métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais(7), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 98/54/CE, estabelece métodos de análise para, inter alia, a determinação do retinol (vitamina A); que, à luz do progresso científico e técnico, o método descrito já não satisfaz os objectivos pretendidos; que é, portanto, conveniente suprimir o método em questão;

(6) Considerando que a Directiva 74/203/CEE da Comissão, de 25 de Março de 1974, quinta directiva que fixa métodos comunitários de análise para o controlo oficial dos alimentos para animais(8), alterada pela Directiva 81/680/CEE(9), estabelece métodos de análise para a determinação do amido e seus produtos de degradação com elevado pelo molecular em alimentos para animais que contenham pedaços, polpa, folhas ou colos secos de beterraba, polpa de batata, leveduras desidratadas, produtos ricos em inulina ou resíduos, amprolium, etopabato, dinitolmida, nicarbazina ou menadiona (vitamina K3); que, à luz do progresso científico e técnico, nenhum dos métodos descritos na directiva satisfaz já os objectivos pretendidos; que é, portanto, conveniente revogar a directiva;

(7) Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente dos Alimentos para Animais,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1.o

Os Estados-membros zelarão por que as análises efectuadas com vista ao controlo oficial dos teores de amprolium, diclazuril e carbadox nos alimentos para animais e pré-misturas o sejam por aplicação dos métodos descritos no anexo da presente directiva.

Artigo 2.o

A Directiva 71/250/CEE é alterada do seguinte modo:

1. No artigo 1.o, são suprimidos os termos "essência de mostarda" e "teobromina".

2. Os pontos 8 e 13 do anexo são suprimidos.

Artigo 3.o

A Directiva 73/46/CEE é alterada do seguinte modo:

1. O artigo 2.o é suprimido.

2. O anexo II é suprimido.

Artigo 4.o

É revogada a Directiva 74/203/CEE (quinta directiva).

Artigo 5.o

Os Estados-membros porão em vigor, o mais tardar em 31 de Outubro de 1999, as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para dar cumprimento à presente directiva. Do facto informarão imediatamente a Comissão.

Os Estados-membros aplicarão essas disposições a partir de 1 de Novembro de 1999.

Quando os Estados-membros adoptarem tais disposições, estas devem incluir uma referência à presente directiva ou ser acompanhadas dessa referência aquando da sua publicação oficial. As modalidades dessa referência serão adoptadas pelos Estados-membros.

Artigo 4.o

A presente directiva entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

Artigo 5.o

Os Estados-membros são os destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas, em 20 de Abril de 1999.

Pela Comissão

Franz FISCHLER

Membro da Comissão

(1) JO L 170 de 3.8.1970, p. 2.

(2) JO L 270 de 14.12.1970, p. 1.

(3) JO L 6 de 12.1.1999, p. 3.

(4) JO L 347 de 23.12.1998, p. 31.

(5) JO L 155 de 12.7.1971, p. 13.

(6) JO L 208 de 24.7.1998, p. 49.

(7) JO L 83 de 30.3.1973, p. 21.

(8) JO L 108 de 22.4.1974, p. 7.

(9) JO L 246 de 29.8.1981, p. 32.

ANEXO

PARTE A

DETERMINAÇÃO DO AMPROLIUM

Cloridrato de cloreto de 1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidinil)metil]-2-picolinio

1. Objectivo e domínio de aplicação

O método permite determinar o amprolium em alimentos para animais e pré-misturas. O limite de detecção é de 1 mg/kg; o limite de determinação de 25 mg/kg.

2. Princípio

Extracção da amostra com uma mistura de metanol e água. Diluição com a fase móvel, filtração com um filtro de membrana e determinação do teor de amprolium por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de permuta catiónica, com um detector de UV.

3. Reagentes

3.1. Metanol.

3.2. Acetonitrilo para HPLC.

3.3. Água para HPLC.

3.4. Solução 0,1 M de di-hidrogenofosfato de sódio

Num balão aferido de 1000 ml, dissolver em água (3.3) 13,80 g de di-hidrogenofosfato de sódio. mono-hidratado, completar o volume com água (3.3) até ao traço de ca1ibração e homogeneizar.

3.5. Solução 1,6 M de perclorato de sódio

Num balão aferido de 1000 ml, dissolver em água (3.3) 224,74 g de perclorato de sódio mono-hidratado, completar o volume com água (3.3) até ao traço de calibração e homogeneizar.

3.6. Fase móvel para HPLC (ver 9.1)

Mistura 450 + 450 + 100 (v+v+v) de acetonitrilo (3.2), solução de di-hidrogenofosfato de sódio (3.4) e solução de perclorato de sódio (3.5). Antes de utilizar a fase móvel, filtrar por um filtro de membrana de 0,22 μm (4.3) e desgaseificar a solução [por exemplo, num banho de ultra-sons (4.4) durante pelo menos 15 minutos].

3.7. Substância padrão: amprolium puro. Cloreto de 1-[(4-amino-2-propilpirimidino-5-il)metil]-2-metilpiridinio, na forma de cloridrato, E750 (ver 9.2).

3.7.1. Solução-padrão mãe de amprolium, 500 μg/ml

Num balão aferido de 100 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 50 mg de amprolium (3.7) e dissolver em 80 ml de metanol (3.1), colocando depois o balão durante 10 minutos no banho ultra-sónico (4.4). Depois do tratamento ultra-sónico, levar a solução à temperatura ambiente, completar o volume com água até ao traço de calibração e homogeneizar. A temperaturas não superiores a 4° C, a solução mantém-se estável durante um mês.

3.7.2. Solução-padrão intermédia de amprolium, 50 μg/ml

Pipetar 5,0 ml da solução-padrão de reserva (3.7.1) para um balão aferido de 50 ml, completar o volume com solvente de extracção (3.8) até ao traço de calibração e homogeneizar. A temperaturas não superiores a 4° C, a solução mantém-se estável durante um mês.

3.7.3. Soluções-padrão de trabalho

Transferir 0,5, 1,0 e 2,0 ml da solução-padrão intermédia (3.7.2) para uma série de balões aferidos de 50 ml. Completar o volume com a fase móvel (3.6) até ao traço de calibração e homogeneizar. As soluções obtidas contêm 0,5, 1,0 e 2,0 μg de amprolium por ml, respectivamente, e são preparadas imediatamente antes da utilização.

3.8. Solvente de extracção.

Mistura 2:1 (v+v) de metanol (3.1) e água.

4. Aparelhagem

4.1. Equipamento de HPLC com sistema de injecção com capacidade de injecção de volumes de 100 μl.

4.1.1. Coluna para cromatografia líquida com 125 mm x 4 mm e enchimento de permuta catiónica Nucleosil 10 SA com granulometria de 10 μm, ou equivalente.

4.1.2. Detector de UV com regulação do comprimento de onda ou detector de fotodíodos.

4.2. Filtro de membrana de PTFE, de 0,45 μm.

4.3. Filtro de membrana, de 0,22 μm.

4.4. Banho de ultra-sons.

4.5. Agitador mecânico ou magnético.

5. Procedimento

5.1. Generalidades

5.1.1. Alimento para animais branco

Na determinação da recuperação (5.1.2), analisa-se um alimento para animais branco, para comprovar a ausência de amprolium e de substâncias interferentes. O alimento para animais branco deve ser de tipo similar ao da amostra e não devem ser detectados amprolium ou substâncias interferentes.

5.1.2. Determinação da recuperação

Para determinar a recuperação, procede-se à análise de um alimento para animais branco ao qual terá sido adicionada uma quantidade de amprolium semelhante à presente na amostra. Para obter uma concentração de 100 mg/kg no branco, transferir 10,0 ml da solução-padrão mãe de amprolium (3.7.1) para um erlenmeyer de 250 ml e concentrar por evaporação até cerca de 0,5 ml. Adicionar 50 g do alimento para animais branco, misturar bem e deixar em repouso durante 10 minutos, misturando de novo várias vezes antes de proceder à extracção (5.2).

Caso não se disponha de um alimento para animais branco de tipo similar ao da amostra (ver 5.1.1), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra a analisar uma quantidade de amprolium semelhante à que já se encontra presente e analisa-se a amostra assim obtida juntamente com a amostra sem adição. A recuperação é calculada por subtracção.

5.2. Extracção

5.2.1. Pré-misturas (teor de amprolium < 1 %) e alimentos para animais

Num erlenmeyer de 500 ml, pesar, com uma aproximação de 0,01 g, 5 a 40 g da amostra, em função do teor de amprolium, e adicionar 200 ml do solvente de extracção (3.8). Colocar o erlenmeyer no banho de ultra-sons (4.4) e deixar actuar durante 15 minutos. Retirar o erlenmeyer do banho e agitar ou misturar durante 1 h em agitador mecânico ou magnético (4.5). Tomar e diluir uma alíquota do extracto com a fase móvel (3.6), de modo a obter um teor de amprolium de 0,5 a 2 ìg/ml, e homogeneizar (ver a observação 9.3). Filtrar 5 a 10 ml desta solução diluída por um filtro de membrana (4.2). Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.3).

5.2.2. Pré-misturas (teor de amprolium >=1 %)

Num erlenmeyer de 500 ml, pesar, com uma aproximação de 0,001 g, 1 a 4 g da pré-mistura, em função do teor de amprolium, e adicionar 200 ml do solvente de extracção (3.8). Colocar o erlenmeyer no banho de ultra-sons (4.4) e deixar actuar durante 15 minutos. Retirar o erlenmeyer do banho e agitar ou misturar durante 1 h em agitador mecânico ou magnético (4.5). Tomar e diluir uma alíquota do extracto com a fase móvel (3.6), de modo a obter um teor de amprolium de 0,5 a 2 μg/ml, e homogeneizar. Filtrar 5 a 10 ml desta solução diluída por um filtro de membrana (4.2). Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.3).

5.3. Determinação por HPLC

5.3.1. Parâmetros

As condições a seguir especificadas são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução de calibração (3.7.3) com 1,0 μg/ml até se obterem alturas de pico e tempos de retenção constantes.

5.3.2. Curva de calibração

Injectar várias vezes cada solução de calibração (3.7.3) e determinar a altura ou área média dos picos para cada concentração. Traçar uma curva de calibração, representando em ordenadas as alturas ou áreas médias dos picos das soluções de calibração e em abcissas as concentrações correspondentes em μg/ml.

5.3.3. Solução da amostra

Injectar várias vezes um volume de extracto da amostra (5.2) idêntico ao utilizado para as soluções de calibração e determinar a altura ou área média dos picos do amprolium.

6. Cálculo dos resultados

A partir da altura ou área média dos picos do amprolium da solução da amostra, determinar a concentração desta em g/ml com base na curva de calibração (5.3.2).

O teor de amprolium, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

[mg/kg]em que:

V= volume, em ml, do solvente de extracção (3.8), de acordo com 5.2 (isto é, 200 ml);

β= concentração de amprolium, em μg/ml, do extracto da amostra (5.2);

f= factor de diluição, de acordo com 5.2;

m= massa, em g, da toma analisada.

7. Validação dos resultados

7.1. Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou com um detector de foto-díodos que permita comparar os espectros do extracto da amostra (5.2) e da solução de calibração (3.7.3) com 2,0 μg/ml.

7.1.1. Co-cromatografia

Adiciona-se uma quantidade apropriada da solução de calibração (3.7.3) a um extracto da amostra (5.2). A quantidade de amprolium adicionada deve ser semelhante à existente no extracto da amostra.

Daí deve resultar unicamente um aumento da altura do pico do amprolium, contabilizadas a quantidade adicionada e a diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial do pico do amprolium do extracto da amostra sem adição.

7.1.2. Detecção com um sistema de foto-díodos

A avaliação dos resultados é feita com base nos seguintes critérios:

a) O comprimento de onda da absorção máxima dos espectros da amostra e do padrão registada no vértice do pico do cromatograma é o mesmo, com uma margem de variação dependente da resolução do sistema de detecção. No caso da detecção com um sistema de díodos, essa margem é tipicamente de +- 2 nm;

b) Entre 210 e 320 nm, os espectros da amostra e do padrão no vértice do pico do cromatograma não diferem entre si nas partes do espectro compreendidas entre 10 % e 100 % de absorvância relativa. Este critério considera-se satisfeito se estiverem presentes os mesmos máximos e o desvio relativo dos dois espectros não exceder 15 % da absorvância do analito-padrão em nenhum ponto observado;

c) Entre 210 e 320 nm, os espectros da curva ascendente, do vértice e da curva descendente do pico do extracto da amostra não diferem entre si nas partes do espectro compreendidas entre 10 % e 100 % de absorvância relativa. Este critério considera-se satisfeito se estiverem presentes os mesmos máximos e o desvio relativo dos espectros em todos os pontos observados não exceder 15 % da absorvância do espectro do vértice do pico.

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não terá sido confirmada.

7.2. Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas para a mesma amostra não deve exceder:

- para teores de amprolium compreendidos entre 25 mg/kg e 500 mg/kg: 15 % do maior dos valores,

- para teores de amprolium compreendidos entre 500 mg/kg e 1000 mg/kg: 75 mg/kg,

- para teores de amprolium superiores a 1000 mg/kg: 7,5 % do maior dos valores.

7.3. Recuperação

Utilizando uma amostra (branco) adicionada, a recuperação deve ser pelo menos de 90 %.

8. Resultados de um teste interlaboratorial

Apresentam-se no quadro seguinte os resultados das análises efectuadas a três alimentos para aves de capoeira (amostras 1 a 3), um suplemento mineral (amostra 4) e uma pré-mistura (amostra 5) no âmbito de um teste interlaboratorial.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

L: número de laboratórios

n: número de valores singelos

sr: desvio-padrão de repetibilidade

CVr: coeficiente de variação da repetibilidade

sR: desvio-padrão da reprodutibilidade

CVR: coeficiente de variação da reprodutibilidade

9. Observações

9.1. Se a amostra contiver tiamina, o pico da tiamina aparecerá no cromatograma imediatamente antes do pico do amprolium. Como o presente método exige a separação do amprolium da tiamina, se a coluna utilizada (4.1.1 ) não efectuar essa separação, substituir o acetonitrilo da fase móvel (3.6) por metanol até ao máximo de 50 % da proporção do primeiro naquela.

9.2. De acordo com a British Pharmacopoeia, o espectro de uma solução 0,02 M de amprolium em ácido clorídrico 0,1 M apresenta máximos a 246 nm e 262 nm. As absorvâncias serão, respectivamente, 0,84 e 0,80.

9.3. O extracto deve ser sempre diluído com fase móvel. Caso contrário, devido a variações da força fónica, o tempo de retenção do pico do amprolium pode apresentar desvios significativos.

PARTE B

DETERMINAÇÃO DO DICLAZURIL

2,6 cloro-alfa-(4-clorofenil)-4-,4,5-dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triacina-2(3H)-yi)benzeno acetonitrilo

1. Objectivo e domínio de aplicação

O método permite determinar o diclazuril em alimentos para animais e pré-misturas. O limite de detecção é de 0,1 mg/kg; o limite de determinação 0,5 mg/kg.

2. Princípio

Depois de adicionado um padrão interno, submete-se a amostra a uma operação de extracção com metanol acidificado. No caso dos alimentos para animais, purifica-se uma alíquota do extracto num cartucho de extracção com fase sólida C18, elui-se o diclazuril do cartucho com uma mistura de metanol acidificado e água, evapora-se e dissolve-se o resíduo em DMF/água. No caso das pré-misturas, evapora-se o extracto e dissolve-se o resíduo em DMF/água. O teor de diclazuril é determinado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, com um detector de UV.

3. Reagentes

3.1. Água para HPLC.

3.2. Acetato de amónio.

3.3. Hidrogenossulfato de tetrabutilamónio (TBHS).

3.4. Acetonitrilo para HPLC.

3.5. Metanol para HPLC.

3.6. N,N-dimetilformamida (DMF).

3.7. Ácido clorídrico, ρ20= 1,19 g/ml.

3.8. Substância-padrão: diclazuril II-24, 2,6 cloro-alfa-(4-clorofenil)-4-,4,5-dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triacina-2(3H)-yi)benzeno acetonitrilo de grau de pureza garantido, E771.

3.8.1. Solução-padrão mãe de diclazuril, 500 μg/ml

Num balão aferido de 50 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 25 mg de diclazuril-padrão (3.8). Dissolver em DMF (3.6), completar o volume com DMF (3.6) até ao traço de calibração e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar num frigorífico. A temperaturas não superiores a 4 °C, a solução mantém-se estável durante um mês.

3.8.2. Solução-padrão de diclazuril, 50 μg/ml

Transferir 5,00 ml da solução-padrão de reserva (3.8.1) para um balão aferido de 50 ml, completar o volume com DMF (3.6) até ao traço de calibração e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar num frigorífico. A temperaturas não superiores a 4 °C, a solução mantém-se estável durante um mês.

3.9. Padrão interno. A substância utilizada é o 2,6-dicloro-a-(4-clorofenil)-4-[4,5-di-hidro-3,5-dioxo1,2,4-triazina-2(3H)-il]-a-metilbenzenoacetonitrilo.

3.9.1. Solução de reserva do padrão interno, 500 μg/ml

Num balão aferido de 50 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 25 mg do padrão interno (3.9), dissolver em DMF (3.6), completar o volume com DMF (3.6) até ao traço de calibração e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar num frigorífico. A temperaturas não superiores a 4° C, a solução mantém-se estável durante um mês.

3.9.2. Solução do padrão interno, 50 μg/ml

Transferir 5,00 ml da solução de reserva do padrão interno (3.9.1) para um balão aferido de 50 ml, completar o volume com DMF (3.6) até ao traço de calibração e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar num frigorífico. A temperaturas não superiores a 4° C, a solução mantém-se estável durante um mês.

3.9.3. Solução do padrão interno para as pré-misturas, p/1000 mg/ml ("p" é o teor nominal, em mg/kg, de diclazuril da pré-mistura)

Num balão aferido de 100 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, p/10 mg do padrão interno, dissolver em DMF (3.6) num banho de ultra-sons (4.6), completar o volume com DMF até ao traço de calibração e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar num frigorífico. A temperaturas não superiores a 4° C, a solução mantém-se estável durante um mês.

3.10. Solução de padrão de trabalho, 2 μg/ml

Pipetar 2,00 ml da solução-padrão de diclazuril (3.8.2) e 2,00 ml da solução do padrão interno (3.9.2) para um balão aferido de 50 ml. Adicionar 16 ml de DMF (3.6), completar o volume com água até ao traço de calibração e homogeneizar. Esta solução é preparada imediatamente antes da utilização.

3.11. Cartucho de extracção com fase sólida C18, por exemplo Bond Elut; volume: 1 cm3, massa de substância sorvente: 100 mg.

3.12. Solvente de extracção: metanol acidificado

Pipetar 5,0 ml de ácido clorídrico (3.7) para um recipiente com 1000 ml de metanol (3.5) e homogeneizar.

3.13. Fase móvel para HPLC.

Eluente A: solução de acetato de amónio e hidrogenossulfato de tetrabutilamónio

3.13.1. Dissolver 5 g de acetato de amónio (3.2) e 3,4 g de TBHS (3.3) em 1000 ml de água (3.1) e homogeneizar.

3.13.2. Eluente B: acetonitrilo (3.4)

3.13.3. Eluente C: metanol (3.5).

4. Aparelhagem

4.1. Agitador mecânico ou magnético.

4.2. Equipamento para HPLC com gradiente ternário.

4.2.1. Coluna para cromatografia líquida com 100 mm x 4,6 mm e enchimento Hypersil ODS com granulometria de 3 μm, ou equivalente.

4.2.2. Detector de UV com regulação do comprimento de onda ou detector de fotodíodos.

4.3. Evaporador rotativo sob vácuo.

4.4. Filtro de membrana, de 0,45 μm.

4.5. Sistema de vácuo.

4.6. Banho de ultra-sons.

5. Procedimento

5.1. Generalidades

5.1.1. Alimento para animais branco

Procede-se à análise de um alimento para animais branco, para comprovar a ausência de diclazuril e de substâncias interferentes. O alimento para animais branco deve ser de tipo similar ao da amostra e não devem ser detectados diclazuril ou substâncias interferentes nas análises.

5.1.2. Determinação da recuperação

Para determinar a recuperação, procede-se à análise de um alimento para animais branco ao qual terá sido adicionada uma quantidade de diclazuril semelhante à presente na amostra. Para obter uma concentração de 1 mg/kg, adicionar 0,1 ml da solução-padrão de reserva (3.8.1) a 50 g do alimento para animais branco, misturar bem e deixar em repouso durante 10 minutos, misturando de novo várias vezes antes de prosseguir (5.2).

Caso não se disponha de um alimento para animais branco de tipo similar ao da amostra (ver 5.1.1), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra a analisar uma quantidade de diclazuril semelhante à que já se encontra presente e analisa-se a amostra assim obtida juntamente com a amostra sem adição. A recuperação é calculada por subtracção.

5.2. Extracção

5.2.1. Alimentos para animais

Pesar, com uma aproximação de 0,01 g, cerca de 50 g de amostra. Transferir a quantidade pesada para um erlenmeyer de 500 ml, adicionar 1,00 ml da solução do padrão interno (3.9.2) e 200 ml do solvente de extracção (3.12) e tapar. Colocar o erlenmeyer no agitador (4.1) e deixar a agitar de um dia para o outro. Deixar assentar durante 10 minutos. Transferir uma alíquota de 20 ml do líquido sobrenadante para um recipiente de vidro adequado e diluir com 20 ml de água. Verter esta solução num cartucho de extracção (3.11) e forçar a passagem por aplicação de vácuo (4.5). Lavar o cartucho com 25 ml de uma mistura 65 + 35 (v + v) de solvente de extracção (3.12) e água. Rejeitar as fracções recolhidas e eluir os compostos retidos com 25 ml de uma mistura 80 + 20 (v + v) de solvente de extracção (3.12) e água. Evaporar esta fracção a 60° C num evaporador rotativo (4.3), suspendendo a operação logo que seja atingida a secura. Dissolver o resíduo em 1,0 ml de DMF (3.6), adicionar 1,5 ml de água (3.1) e homogeneizar. Filtrar por um filtro de membrana (4.4). Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.3).

5.2.2. Pré-misturas

Pesar, com uma aproximação de 0,001 g, cerca de 1 g de amostra. Transferir a quantidade pesada para um erlenmeyer de 500 ml, adicionar 1,00 ml da solução do padrão interno (3.9.3) e 200 ml do solvente de extracção (3.12) e tapar. Colocar o erlenmeyer no agitador (4.1 ) e deixar a agitar de um dia para o outro. Deixar assentar durante 10 minutos. Transferir uma aliquota de 10.000/p ml ("p" é o teor nominal, em mg/kg, de diclazuril na pré-mistura) do líquido sobrenadante para um balão de vidro de fundo redondo de volume adequado. Evaporar a 60° C, sob pressão reduzida, num evaporador rotativo (4.3), suspendendo a operação logo que seja atingida a secura. Redissolver o resíduo em 10,0 ml de DMF (3.6), adicionar 15,0 ml de água (3.1) e homogeneizar. Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.3).

5.3. Determinação por HPLC

5.3.1. Parâmetros

As condições a seguir especificadas são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução de calibração (3.10), de concentração 2,0 μg/ml, até se obterem alturas de pico e tempos de retenção constantes.

5.3.2. Solução de calibração

Injectar várias vezes 20 μl da solução padrão de trabalho (3.10) e determinar a altura ou área média dos picos do diclazuril e do padrão interno.

5.3.3. Solução da amostra

Injectar várias vezes 20 μl da solução da amostra (5.2.1 ou 5.2.2) e determinar a altura ou área média dos picos do diclazuril e do padrão interno.

6. Cálculo dos resultados

6.1. Alimentos para animais

O teor de diclazuril, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

[mg/kg]em que:

hd,s= altura ou área do pico do diclazuril da solução da amostra (5.2.1);

hi,s= altura ou área do pico do padrão interno da solução da amostra (5.2.1);

hd,c= altura ou área do pico do diclazuril da solução de calibração (3.10);

hi,c= altura ou área do pico do padrão interna da solução de calibração (3.10);

βd,c= concentração de diclazuril, em μg/ml, da solução de calibração (3.10);

m= massa, em g, da toma analisada;

V= volume, em ml, do extracto da amostra, de acordo com 5.2.1 (isto é, 2,5 ml).

6.2. Pré-misturas

O teor de diclazuril, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

[mg/kg]hd,c= altura ou área do pico do diclazuril da solução de calibração (3.10);

hi,c= altura ou área do pico do padrão interno da solução de calibração (3.10);

hd,s= altura ou área do pico do diclazuril da solução da amostra (5.2.2);

hi,s= altura ou área do pico do padrão interno da solução da amostra (5.2.2);

βd,c= concentração de diclazuril da solução de calibração (3.10);

m= massa, em g, da toma analisada;

V= volume do extracto da amostra, de acordo com 5.2.2 (isto é, 25 ml);

p= teor nominal, em mg/kg, de diclazuril da pré-mistura.

7. Validação dos resultados

7.1. Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou com um detector de foto-díodos que permita comparar os espectros do extracto da amostra (5.2.1 ou 5.2.2) e da solução de calibração (3.10).

7.1.1. Co-cromatografia

Adiciona-se uma quantidade apropriada da solução de calibração (3.10) a um extracto da amostra (5.2.1 ou 5.2.2). A quantidade de diclazuril adicionada deve ser semelhante à existente no extracto da amostra.

Daí deve resultar unicamente um aumento da altura do pico do diclazuril e do pico do padrão interno, contabilizadas a quantidade adicionada e a diluição do extracto. A largura a meia altura desses picos não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial do pico do diclazuril e do pico do padrão interno, respectivamente, do extracto da amostra sem adição.

7.1.2. Detecção com um sistema de foto-díodos

A avaliação dos resultados é feita com base nos seguintes critérios:

a) O comprimento de onda da absorção máxima dos espectros da amostra e do padrão registada no vértice do pico do cromatograma é o mesmo, com uma margem de variação dependente da resolução do sistema de detecção. No caso da detecção com um sistema de díodos, essa margem é tipicamente de +- 2 nm;

b) Entre 230 e 320 nm, os espectros da amostra e do padrão no vértice do pico do cromatograma não diferem entre si nas partes do espectro compreendidas entre 10 % e 100 % de absorvância relativa. Este critério considera-se satisfeito se estiverem presentes os mesmos máximos e o desvio relativo dos dois espectros não exceder 15 % da absorvância do analito-padrão em nenhum ponto observado;

c) Entre 230 e 320 nm, os espectros da curva ascendente, do vértice e da curva descendente do pico do extracto da amostra não diferem entre si nas partes do espectro compreendidas entre 10 % e 100 % de absorvância relativa. Este critério considera-se satisfeito se estiverem presentes os mesmos máximos e o desvio relativo dos espectros em todos os pontos observados não exceder 15 da absorvância do espectro do vértice do pico.

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não terá sido confirmada.

7.2. Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas para a mesma amostra não deve exceder:

- para teores de diclazuril compreendidos entre 0,5 mg/kg e 2,5 mg/kg: 30 % do maior dos valores,

- para teores de diclazuril compreendidos entre 2,5 mg/kg e 5 mg/kg: 0,75 mg/kg,

- para teores de diclazuril superiores a 5 mg/kg: 15 % do maior dos valores.

7.3. Recuperação

Utilizando uma amostra (branco) adicionada, a recuperação deve ser pelo menos de 80 %.

8. Resultados de um teste interlaboratorial

Foi organizado um teste interlaboratorial, que envolveu a análise de cinco amostras em 11 laboratórios. Foram analisadas duas amostras de pré-misturas (uma, O 100, misturada com uma matriz orgânica; a outra, A 100, com uma matriz inorgânica), com um teor teórico de diclazuril de 100 mg/kg, e três amostras (L1, Z1 e K1) de misturas alimentares para aves de capoeira de três produtores distintos dos Países Baixos, com um teor teórico de diclazuril de 1 mg/kg. Os laboratórios receberam instruções para analisarem cada amostra uma vez ou em duplicado. (No Journal of AOAC Internationa/, Volume 77, n.o 6, 1994, p. 1359-1361 podem ser encontrados elementos mais pormenorizados sobre o teste interlaboratorial efectuado.) Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

L: número de laboratórios

n: número de valores singelos

Sr: desvio-padrão da repetibilidade

CVr: coeficiente de variação da repetibilidade

SR: desvio-padrão da reprodutibilidade

CVR: coeficiente de variação da reprodutibilidade

9. Observações

É necessário comprovar previamente a linearidade da resposta ao diclazuril em toda a gama de concentrações objecto das determinações.

PARTE C

DETERMINAÇÃO DO CARBADOX

N1,N4-Dióxido de metil-3-(2-quinoxalinilmetileno)carbazato

1. Objectivo e domínio de aplicação

O método permite determinar o carbadox em alimentos para animais, pré-misturas e preparações. O limite de detecção é de 1 mg/kg; o limite de determinação 10 mg/kg.

2. Princípio

Adição de água à amostra, estabilização e extracção com uma mistura de metanol e acetonitrilo. No caso dos alimentos para animais, limpeza de uma alíquota do extracto filtrado numa coluna de óxido de alumínio. No caso das pré-misturas e preparações, diluição apropriada de uma alíquota do extracto filtrado com água, metanol e acetonitrilo. Determinação do teor de carbadox por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa, com um detector de UV.

3. Reagentes

3.1. Metanol.

3.2. Acetonitrilo para HPLC.

3.3. Ácido acético a 100 %.

3.4. Óxido de alumínio (neutro, grau de actividade I).

3.5. Mistura 1 + 1 (v + v) de metanol e acetonitrilo.

Misturar 500 ml de metanol (3.1) com 500 ml de acetonitrilo (3.2).

3.6. Ácido acético a 10 %

Diluir 10 ml de ácido acético (3.3) com água até ao volume total de 100 ml.

3.7. Acetato de sódio (CH3COONa).

3.8. Água para HPLC.

3.9. Tampão acetato (0,01 M, pH 6,0)

Dissolver 0,82 g de acetato de sódio (3.7) em 700 ml de água (3.8) e ajustar o pH a 6,0 com ácido acético (3.6). Transferir para um balão aferido de 1000 ml, completar o volume com água (3.8) até ao traço de calibração e homogeneizar.

3.10. Fase móvel para HPLC

Misturar 825 ml de tampão acetato (3.9) com 175 ml de acetonitrilo (3.2). Filtrar com um filtro de 0,22 μm (4.5) e desgaseificar a solução (por exemplo por aplicação de ultra-sons durante 10 minutos).

3.11. Substância padrão

Carbadox puro: N1,N4-dióxido-3-(2-quinoxalinilmetileno)carbazato de metilo, E850.

3.11.1. Solução-padrão mãe de carbadox, 100 μg/ml, de carbadox (vera nota ao ponto 5, "Procedimento")

Num balão aferido de 250 ml, pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 25 mg de carbadox-padrão (3.11) e dissolver com a mistura de metanol e acetonitrilo (3.5) por aplicação de ultra-sons (4.7). Depois do tratamento ultrassónico, levar a solução à temperatura ambiente, completar o volume com a mistura de metanol e acetonitrilo (3.5) até ao traço de calibração e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio ou utilizar material de vidro ambarizado e guardar num frigorífico. A temperaturas não superiores a 4° C, a solução mantém-se estável durante um mês.

3.11.2. Soluções-padrão de trabalho

Transferir 2,0, 5,0, 10,0 e 20,0 ml da solução-padrão de reserva (3.11.1) para uma série de balões aferidos de 100 ml. Adicionar 30 ml de água, completar o volume com a mistura de metanol e acetonitrilo (3.5) até ao traço de calibração e homogeneizar. Envolver o balão com folha de alumínio. As soluções obtidas contêm 2,0, 5,0, 10,0 e 20,0 μg de carbadox por ml, respectivamente, e são preparadas imediatamente antes da utilização.

Nota:

Para a determinação de teores de carbadox inferiores a 10 mg/kg em alimentos para animais, preparar soluções de calibração com concentração inferior a 2,0 μg/ml.

3.12. Mistura 300 + 700 (v + v) de água e mistura de metanol e acetonitrilo (3.5)

Misturar 300 ml de água com 700 ml da mistura de metanol e acetonitrilo (3.5).

4. Aparelhagem

4.1. Agitador mecânico ou magnético.

4.2. Papel de filtro de fibra de vidro (Whatman GF/A ou equivalente).

4.3. Coluna de vidro sinterizado (300 a 400 mm de comprimento e diâmetro interno aproximado de 10 mm) com válvula de escoamento.

Nota:

Também pode utilizar-se uma coluna de vidro com torneira ou uma coluna de vidro com uma das extremidades afunilada; neste caso, inserir um tampão de fibra de vidro com uma vareta de vidro e comprimir contra o fundo.

4.4. Equipamento de HPLC com sistema de injecção com capacidade de injecção de volumes de 20 μl.

4.4.1. Coluna para cromatografia líquida com 300 mm x 4 mm e enchimento C18 com granulometria de 10 μm, ou equivalente.

4.4.2. Detector de UV com regulação do comprimento de onda ou detector de fotodíodos para comprimentos de onda compreendidos entre 225 nm e 400 nm.

4.5. Filtro de membrana, de 0,22 μm.

4.6. Filtro de membrana, de 0,45 μm.

4.7. Banho de ultra-sons

5. Procedimento

Nota:

O carbadox é sensível à luz. Trabalhar com luz difusa ou utilizar material de vidro ambarizado ou envolvido em folha de alumínio.

5.1. Generalidades

5.1.1. Alimento para animais branco

Na determinação da recuperação (5.1.2), analisa-se um alimento para animais branco, para comprovar a ausência de carbadox e de substâncias interferentes. O alimento para animais branco deve ser de tipo similar ao da amostra e não devem ser detectados carbadox ou substâncias interferentes nas análises.

5.1.2. Determinação da recuperas

Para determinar a recuperação, procede-se à análise de um alimento para animais branco (5.1.1) ao qual terá sido adicionada uma quantidade de carbadox semelhante à presente na amostra. Para obter uma concentração de 50 mg/kg no branco, transferir 5,0 ml da solução-padrão mãe de carbadox (3.11.1) para um erlenmeyer de 200 ml e concentrar por evaporação numa corrente de azoto até cerca de 0,5 ml. Adicionar 10 g do alimento para animais branco, misturar e deixar em repouso durante 10 minutos antes de proceder à extracção (5.2).

Caso não se disponha de um alimento para animais branco de tipo similar ao da amostra (ver 5.1.1), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra uma quantidade de carbadox semelhante à que já se encontra presente e analisa-se a amostra assim obtida juntamente com a amostra sem adição. A recuperação é calculada por subtracção.

5.2. Extracção

5.2.1. Alimentos para animais

Pesar, com uma aproximação de 0,01 g, cerca de 10 g de amostra. Transferir a quantidade pesada para um erlenmeyer de 200 ml, adicionar 15,0 ml de água, homogeneizar e deixar estabilizar durante cinco minutos. Adicionar 35,0 ml da mistura de metanol e acetonitrilo (3.5), tapar e agitar ou misturar durante 30 minutos no agitador mecânico ou magnético (4.1). Filtrar a solução obtida por um papel de filtro de fibra de vidro (4.2). Guardar a solução para posterior purificação (5.3).

5.2.2. Pré-misturas (0,1-2,0 %)

Pesar, com uma aproximação de 0,001 g, cerca de 1 g de amostra não triturada. Transferir a quantidade pesada para um erlenmeyer de 200 ml, adicionar 15,0 ml de água, homogeneizar e deixar estabilizar durante cinco minutos. Adicionar 35,0 ml da mistura de metanol e acetonitrilo (3.5), tapar e agitar ou misturar durante 30 minutos no agitador mecânico ou magnético (4.1). Filtrar a solução obtida por um papel de filtro de fibra de vidro (4.2). Pipetar uma alíquota do filtrado para um balão aferido de 50 ml. Adicionar 15,0 ml de água, completar o volume com a mistura de metanol e acetonitrilo (3.5) até ao traço de calibração e homogeneizar. A concentração de carbadox na solução foral deve ser próxima de 10 μg/ml. Filtrar uma alíquota com um filtro de 0,45 mm (4.6). Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.4).

5.2.3. Preparações ( >2 %)

Pesar, com uma aproximação de 0,001 g, cerca de 0,2 g de amostra não triturada. Transferir a quantidade pesada para um erlenmeyer de 250 ml, adicionar 45,0 ml de água, homogeneizar e deixar estabilizar durante cinco minutos. Adicionar 105,0 ml da mistura de metanol e acetonitrilo (3.5), tapar e homogeneizar. Aplicar ultra-sons (4.7) à amostra durante 15 minutos e agitar ou misturar durante mais 15 minutos (4.1). Filtrar a solução obtida com um papel de filtro de fibra de vidro (4.2). Diluir uma alíquota do filtrado com a mistura de água, metanol e acetonitrilo (3.12) de modo a obter uma concentração final de carbadox de 10-15 μg/ml (para uma preparação a 10 %, o factor de diluição é 10). Filtrar uma alíquota com um filtro de 0,45 μm (4.6). Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.4).

5.3. Purificação

5.3.1. Preparação da coluna de óxido de alumínio

Pesar 4 g de óxido de alumínio (3.4) e transferir a quantidade pesada para a coluna de vidro (4.3).

5.3.2. Purificação da amostra

Verter 15 ml do extracto filtrado (5.2.1) na coluna de óxido de alumínio e rejeitar os primeiros 2 ml de eluato. Recolher os 5 ml seguintes e filtrar uma aliquota por um filtro de 0,45 μm (4.6). Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.4).

5.4. Determinação por HPLC

5.4.1. Parâmetros

As condições a seguir especificadas são-no a titulo indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução-padrão de trabalho (3.11.2) com 5,0 μg/ml até se obterem alturas ou áreas de pico e tempos de retenção constantes.

5.4.2. Curva de calibração

Injectar várias vezes cada solução de calibração (3.11.2) e determinar as alturas ou áreas dos picos para cada concentração. Traçar uma curva de calibração, representando em ordenadas as alturas ou áreas médias dos picos das soluções de calibração e em abcissas as concentrações correspondentes em μg/ml.

5.4.3. Solução da amostra

Injectar várias vezes o extracto da amostra [(5.3.2) no caso dos alimentos para animais, (5.2.2) no caso das pré-misturas e (5.2.3) no caso das preparações] e determinar a altura ou área média dos picos do carbadox.

6. Cálculo dos resultados

A partir da altura ou área média dos picos do carbadox da solução da amostra, determinar a concentração desta em μg/ml com base na curva de calibração (5.4.2).

6.1. Alimentos para animais

O teor de carbadox, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

[mg/kg]em que:

β= concentração de carbadox, em μg/ml, do extracto da amostra (5.3.2);

V1= volume de extracção, em ml (isto é, 50 ml);

m= massa, em g, da toma analisada.

6.2. Pré-misturas e preparações

O teor de carbadox, w, da amostra, expresso em mg/kg, é dado pela seguinte fórmula:

>REFERÊNCIA A UM GRÁFICO>

[mg/kg]em que:

β= concentração de carbadox, em μg/ml, do extracto da amostra (5.2.2 ou 5.2.3);

V2= volume de extracção, em ml (isto é, 50 ml no caso das pré-misturas e 150 ml no caso das preparações);

f= factor de diluição, de acordo com 5.2.2 (pré-misturas) ou 5.2.3 (preparações);

m= massa, em g, da toma analisada.

7. Validação dos resultados

7.1. Identidade

A identidade do analito pode ser confirmada por co-cromatografia ou com um detector de foto-díodos que permita comparar os espectros do extracto da amostra e da solução de calibração (3.11.2) com 10,0 μg/ml.

7.1.1. Co-cromatografia

Adiciona-se uma quantidade apropriada da solução de calibração (3.11.2) a um extracto da amostra. A quantidade de carbadox adicionada deve ser semelhante à que se prevê existir no extracto da amostra.

Daí deve resultar unicamente um aumento da altura do pico do carbadox, contabilizadas a quantidade adicionada e a diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10 % da largura inicial.

7.1.2. Detecção com um sistema de foto-díodos

A avaliação dos resultados é feita com base nos seguintes critérios:

a) O comprimento de onda da absorção máxima dos espectros da amostra e do padrão registada no vértice do pico do cromatograma é o mesmo, com uma margem de variação dependente da resolução do sistema de detecção. No caso da detecção com um sistema de díodos, essa margem é tipicamente de +- 2 nm;

b) Entre 225 e 400 nm, os espectros da amostra e do padrão no vértice do pico do cromatograma não diferem entre si nas partes do espectro compreendidas entre 10 % e 100 % de absorvância relativa. Este critério considera-se satisfeito se estiverem presentes os mesmos máximos e o desvio relativo dos dois espectros não exceder 15 % da absorvância do analito-padrão em nenhum ponto observado;

c) Entre 225 e 400 nm, os espectros da curva ascendente, do vértice e da curva descendente do pico do extracto da amostra não diferem entre si nas partes do espectro compreendidas entre 10 % e 100 % de absorvância relativa. Este critério considera-se satisfeito se estiverem presentes os mesmos máximos e o desvio relativo dos espectros em todos os pontos observados não exceder 15 da absorvância do espectro do vértice do pico.

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não terá sido confirmada.

7.2. Repetibilidade

Para teores iguais ou superiores a 10 mg/kg, a diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas para a mesma amostra não deve exceder 15 % do maior dos valores;

7.3. Recuperação

Utilizando uma amostra (branco) adicionada, a recuperação deve ser pelo menos de 90 %.

8. Resultados de um teste interlaboratorial

Foi organizado um teste interlaboratorial, que envolveu a análise de seis alimentos para animais, quatro pré-misturas e três preparações em oito laboratórios. Cada amostra foi analisada em duplicado. (No Journal of the AOAC, Volume 71, 1988, p. 484-490 podem ser encontrados elementos mais pormenorizados sobre o teste interlaboratorial efectuado.) Os resultados obtidos (com excepção dos valores anómalos) são apresentados no quadro seguinte:em que:

L: número de laboratórios

n: número de valores singelos

Sr: desvio-padrão da repetibilidade

CVr: coeficiente de variação da repetibilidade

SR: desvio-padrão da reprodutibilidade

CVR: coeficiente de variação da reprodutibilidade

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>